Anti - herpes 67

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Purificazione e caratterizzazione di Eugeniin come un composto anti-herpesvirus da Geum japonicum e Syzygium aromaticum Estratto L'estratto di acqua calda di Geum japonicum ha dimostrato di esibire profilattico e terapeutico anti-virus herpes simplex (HSV) l'attività in modelli murini di infezione. Eugeniin è stato purificato come un composto anti-HSV dall'estratto ed anche è stato isolato da un altro estratto di erbe (Syzygium aromaticum), che aveva esposto anti-HSV attività nei topi. Così l'azione anti-HSV di eugeniin stata caratterizzata. La concentrazione effettiva (5,0 g / ml) per 50 riduzione delle placche di eugeniin per selvaggio HSV tipo 1 (HSV-1) su cellule Vero era 13,9 volte inferiore a sua concentrazione 50 citotossica determinati mediante esame resa-riduzione. Eugeniin anche inibito la crescita di acyclovir-phosphonoacetic antiacido HSV-1, timidina chinasi-carente HSV-1 e HSV selvaggio di tipo 2. Eugeniin così come l'acido phosphonoacetic inibito DNA virale e tardiva sintesi di proteine ​​virali nelle loro cellule Vero infettate, ma non sintesi proteica cellulare nelle sue concentrazioni inibitorie. Purificata HSV-1 DNA polimerasi è stata inibita da eugeniin noncompetitively rispetto dTTP. La sua apparente K i rapporto qualità-euginiin era 8.2- e 5,8 volte più bassa rispetto alla K valori i di purificati DNA polimerasi umane e, rispettivamente. Così uno dei maggiori siti di destinazione di azione inibitoria di eugeniin è DNA virale sintesi l'azione inibitoria per virale attività di DNA polimerasi è stata romanzo confrontato con gli analoghi nucleosidici anti-HSV-. Anti-herpes agenti simplex virus, analoghi principalmente nucleosidici come ACV, sono stati sviluppati (Elion et al. 1977) e utilizzato per il trattamento di infezione da HSV nell'uomo (Dunkle et al. 1991 Fiddian et al. 1984 Meyers et al. 1982 Whitley et al. 1991). Tuttavia, la comparsa di ceppi HSV ACV-resistenti è diventato evidente nei pazienti immunodepressi, come i pazienti sottoposti a trapianto d'organo e nei pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita (Birch et al. 1990 Coen 1994 Erlich et al. 1989 Norris et al., 1988 Nugier et al . 1992 Oliver et al. 1989 Pelosi et al., 1992 Reusser et al., 1996 Sibrack et al. 1982). Tali virus ACV-resistenti sono anche resistenti agli altri analoghi nucleosidici (Nugier et al. 1992). Pertanto è richiesto lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici con diversa modalità di azione anti-HSV. Abbiamo già selezionato 12 estratti di erbe con attività orale terapeutica antivirale contro cutanea HSV-1 nei topi da 142 erbe medicinali (Kurokawa et al. 1993b). Tra i 12 estratti di erbe, la somministrazione orale di quattro estratti aumentata l'efficacia terapeutica di ACV in topi e ha mostrato potente anti HSV-1-attività contro ACV-PAA-resistente (AP r) HSV-1 e selvatici HSV-2 ceppi in vitro e in vivo (Kurokawa et 1995a. al., b). Questi quattro estratti di erbe esposti anche efficacia profilattica contro la reiterazione del HSV-1 malattia nei topi (Kurokawa et al. 1997). La loro azione anti-HSV inibita HSV sintesi del DNA e la modalità di azione anti-HSV è differente da quelli di ACV e PAA (Kurokawa et al. 1995b). Tra questi quattro estratti di erbe, la frazione EtOAc-estraibile del estratto di erbe di Geum japonicum Thunb. ESPOSTI anti-HSV-1 in un saggio resa riduzione in vitro e cutanea HSV-1 modello di infezione nei topi (Kurokawa et al.. 1993a). Così, la frazione EtOAc-estraibile può contenere composti anti-HSV che vengono assorbiti dal tratto alimentari dopo somministrazione orale. In questo studio, abbiamo isolato e identificato un anti-HSV composto, eugeniin, dagli estratti di erbe non solo di G. japonicum ma anche Syzygium aromaticum MERR (L.). et PERRY, che sono due delle quattro estratti di erbe con attività anti-HSV in vitro e in vivo riportato in precedenza (Kurokawa et al. 1993a. 1993b. 1995a. 1995b. 1997). Così l'azione del composto anti-HSV isolati coincidenza delle due diverse erbe officinali stato caratterizzato. Uno dei principali siti bersaglio di azione inibitoria di eugeniin è risultato essere la sintesi del DNA virale. Esso ha mostrato una maggiore specificità per l'inibizione di HSV-1 DNA polimerasi di quello di attività della DNA polimerasi cellulare. La sua specificità per HSV-1 DNA polimerasi e il suo indice terapeutico è maggiore rispetto a quelli di Vidarabine (Ara-A) che è stato usato clinicamente per il trattamento della malattia erpetica (Coen et al.. 1982 Seidlin e Straus 1984 Whitley et al.. 1986). L'azione inibitoria di eugeniin per HSV-1 DNA polimerasi era non competitivo, ad esempio un inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa di HIV-1, nevirapina (Carr e Cooper 1996 Kilby e Saag 1996 Kopp et al.. 1991 Romero et al .. 1991). Così eugeniin può essere un romanzo promettente agente anti-HSV che è diverso da anti-HSV analoghi nucleosidici. MATERIALI E METODI virus e cellule. I ceppi HSV utilizzati erano wild-type 7401H HSV-1 (Kurokawa et al. 1993b), TK B2006 HSV-1 (Dubbs e Kit, 1964), AP r HSV-1 (Kurokawa et al., 1995a) e la wild tipo HSV-2 (Ito-1262) (Kurokawa et al. 1995a, 1995b). Queste riserve di virus sono stati preparati da cellule Vero infettate come riportato in precedenza (Kurokawa et al. 1995a. 1995b). cellule Vero sono state coltivate e mantenute in Eagles MEM supplementato con siero 5 e 2 polpaccio, rispettivamente. Per la preparazione di HSV-1 DNA polimerasi e DNA polimerasi cellulare e, cellule HEL sono state coltivate e mantenute in MEM supplementato con 10 e 2 di siero fetale bovino, rispettivamente. Frazionamento di estratti di erbe e l'identificazione dei composti purificati. composti anti-HSV sono stati purificati da estratti di erbe, con l'uso di diversi frazionamenti cromatografiche guidate da attività anti-HSV. estratti di acqua calda sono stati preparati da essiccata G. japonicum e poi estratti con EtOAc come descritto in precedenza (Kurokawa et al. 1993a. 1993b). La frazione EtOAc-estraibile è stato ulteriormente estratto con metanolo. La frazione solubile metanolo è stato separato per Sephadex LH-20 cromatografia in colonna eluendo 50 metanolo in acqua e aumentando la percentuale di metanolo. Ogni frazione separata è stato essiccato sotto vuoto. Il residuo viene sciolto in DMSO a 20 mg / ml ed esaminato per anti-HSV-1 mediante il saggio di placca riduzione con cellule Vero come descritto di seguito. Le frazioni che mostrano la più forte contro HSV-1-attività tra tutte le frazioni separate sono stati ulteriormente risolti da una fase inversa (colonna Shim-pack Prep-ODC (H), Shimadzu, Kyoto, Giappone) HPLC con 27,5 di acetonitrile a 1/15 M tampone fosfato, pH 3,7. Le frazioni separate sono stati estratti tre volte con EtOAc, e le fasi EtOAc-solubili raccolti sono stati essiccati sotto vuoto. Il residuo è stato sciolto in DMSO ed esaminato per-HSV-1 attività anti. La struttura chimica di un composto ottenuto da una frazione con la più forte contro HSV-1-attività tra le frazioni HPLC è stato determinato confrontando la sua spettrali NMR, dati rotatorio e profili di spettrometria di massa con quelli in letteratura (Lee et al. 1990 Nonaka et al. 1980). Eugeniin (fig. 1) è stato identificato come un composto anti-HSV nell'estratto erbe di G. japonicum. Questo composto è stato anche isolato come un composto anti-HSV dall'estratto vegetale di S. aromaticum da EtOAc ed estrazioni metanolo e successive separazioni cromatografiche come riportato da Takechi e Tanaka (1981). Struttura di eugeniin. saggio di placca-riduzione e test di citotossicità. Frazioni separati in ogni passaggio per frazionamento di estratti di erbe sono stati esaminati per l'attività anti-HSV nel saggio di placca-riduzione. culture duplicate su cellule Vero in piatti di plastica di 60 mm, sono state infettate con 100 PFU di selvaggio HSV-1 per 1 ora. Le cellule sono state sovrapposte con 5 ml di metilcellulosa nutrienti (0,8) terreno contenente varie concentrazioni di campioni e poi coltivate a 37 ° C per 2 giorni. Le cellule sono state fissate e colorate, e il numero di placche sono stati contati come descritto in precedenza (Kurokawa et al. 1995a). Le concentrazioni efficaci di riduzione delle placche 50 (EC 50) sono stati determinati da una curva relativa al numero di targa alla concentrazione dei campioni. La citotossicità di ogni frazione è stata esaminata misurando il suo effetto sulla incorporazione di metil 3 Hthymidine nel DNA di cellule Vero, come descritto in precedenza (Kurokawa et al. 1995a). Cellule Vero (2,5 10 4 cellule / pozzetto) sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti per 2 giorni. Il terreno di coltura è stato sostituito con mezzo fresco contenente 37 kBq di metil - 3 Hthymidine (3,11 TBq / mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK) e eugeniin a varie concentrazioni. Dopo un periodo di crescita esponenziale 18-h delle cellule, le cellule sono state lisate. I lisati sono stati avvistati su filtri di carta, e poi la radioattività sui filtri lavati e asciugati stati determinati in un contatore a scintillazione liquida. Per un saggio di crescita inibizione, cellule HEL e cellule Vero sono state seminate ad una concentrazione di 5 10 4 cellule / pozzetto in piastre da 24 pozzetti e coltivate a 37 ° C per 2 giorni. Il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco contenente eugeniin a varie concentrazioni, e le cellule sono state coltivate ulteriormente per 2 giorni. Le cellule in pozzetti in triplicato per ciascuna concentrazione di eugeniin sono stati trattati con tripsina, e il numero di cellule vitali è stata determinata da un test di esclusione del trypan blue. La concentrazione 50 citotossica (CC 50) è stato determinato graficamente (Kurokawa et al. 1995a). saggio di rendimento-riduzione. Eugeniin stato confrontato per la sua attività antivirale contro selvaggio HSV-1, AP r HSV-1, TK HSV-1 e HSV-2 selvatici ceppi nel test resa-riduzione. Monostrati di cellule Vero a 25 cm flaconi di plastica 2 sono stati infettati con ogni ceppo HSV a 5 a 10 PFU / cellula per 1 ora. Le cellule sono state lavate tre volte con MEM e incubate in terreno di mantenimento contenente varie concentrazioni di eugeniin a 37 ° C per 24 h. Le colture sono state congelate e scongelate e poi centrifugate a 3000 rpm per 15 min. I titoli virali in mezzo di coltura sono stati determinati mediante il saggio di placca su cellule Vero (Kurokawa et al., 1995a). Analisi della sintesi del DNA virale. Gli effetti di eugeniin e PAA sulla sintesi del DNA virale sono stati confrontati in cellule Vero infettate con wild HSV-1 o AP r HSV-1 ceppi. Monostrati di cellule Vero in piatti di plastica 60 mm, sono state infettate con ceppi HSV (5 PFU / cellula) per 1 h, quindi incubate in terreno di mantenimento contenente varie concentrazioni di eugeniin o 150 g / ml di PAA a 37 ° C per 8 h. Le cellule sono state lisate in presenza di 0,5 SDS e 100 g / ml di proteinasi K, e poi il DNA è stato preparato dai lisati come descritto in precedenza (Kurokawa et al. 1990 1995b). Il DNA è stato cancellato di filtri di nylon (Hybond-N, Amersham) per un apparecchio di slot-blot (Bio-Rad, Hercules, CA) e fissato mediante irradiazione UV. I filtri sono stati prehybridized a 60 ° C per 4 ore e poi incubate con sonde radioattive denaturati a 60 ° C durante la notte. Le sonde radioattive stati sintetizzati dai frammenti di DNA del gene HSV-1 TK da un kit di etichettatura DNA innesco casuale (Takara Biochemicals Kusatu, Giappone) (Kurokawa et al. 1995b). I filtri ibridati sono stati lavati, essiccati ed esposti a pellicole per raggi X a 80C (Kurokawa et al. 1990). Analisi della sintesi proteica virale. Eugeniin è stato esaminato per il suo effetto sulla sintesi proteica virale nelle cellule Vero infettate con wild HSV-1, AP r HSV-1 o selvatici HSV-2 ceppi. Le cellule sono state mock-infettate o infettate con ceppi HSV e incubate in presenza di varie concentrazioni di eugeniin o 150 g / ml di PAA a 37C. HSV-infetti e cellule mock-infettate era etichettato con 35 Smethionine e 35 Scysteine ​​(43,5 TBq / mmol, NEN, Boston, MA) per 5.5 e 7.5 h postinfection in presenza di eugeniin o PAA come descritto sopra. Le cellule marcate sono state lisate e le proteine ​​virali sono stati immunoprecipitati con immunoglobuline per uso umano (Miles Inc. Elkart, IN) (Kurokawa et al. 1995b). Gli immunoprecipitati e lisati cellulari totali sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide seguito da fluorography (Kurokawa et al. 1990. 1995b). I gel secchi sono stati esposti a pellicole per raggi X a 80C. bande proteiche sui film esposti sono stati scansionati con un Bio-Rad Immagine Sistemi di analisi con Fluor-S TM MultiImager e quantitativamente analizzati da software per Macintosh, Multi-Analyst 1.0. Preparazione del DNA polimerasi. HSV-1 DNA polimerasi e DNA polimerasi cellulare e sono stati preparati per esaminare le proprietà enzymological contro eugeniin. HSV-1 DNA polimerasi è stato parzialmente purificato dal selvatici cellule HEL HSV-1-infetti mediante estrazione alto sale, DEAE-cellulosa e cromatografia su colonna di fosfocellulosa come descritto altrove (Nishiyama et al. 1984 Powell e Purifoy 1977 Yoshida et al. 1974) . DNA polimerasi cellulare e sono stati parzialmente purificato da cellule HEL dalla DEAE-cellulosa e cromatografia su colonna fosfocellulosa come riportato altrove (Ono 1987 Ostrander e Cheng 1980 Powell e Purifoy, 1977). Le attività specifiche di HSV-1 DNA polimerasi e DNA cellulare polimerasi e sono stati 3.587, 29 e 76 U / mg di proteine, rispettivamente. Una unità di attività è stata definita come una quantità che catalizza l'incorporazione di 1 nmol di 3 HdTMP in una frazione di acido insolubile in un'ora a 37 ° C nelle condizioni specifiche per ciascun enzima con 6,84 M 3 HdTTP (2.042.85 TBq / mmol, Moravek Biochemicals, Inc. Brea, CA) e 80 M dATP, dCTP 80 M e 80 M dGTP. Saggio di attività DNA polimerasi. La miscela di reazione (25 l) per un saggio di parzialmente purificato HSV-1 polimerasi DNA conteneva 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 8 mM MgCl 2. 0.5 mM DTT, 100 mm solfato di ammonio, 80 M dATP, 80 M dGTP e dCTP 80 M, 0,214-3,42 M 3 HdTTP, 50 g / ml attivato timo di vitello DNA (Sigma), varie concentrazioni di eugeniin e l'enzima. Le miscele di reazione sono state incubate a 37 ° C per 10 min, e la radioattività acido insolubile è stata misurata come descritto altrove (Nishiyama et al. 1984 Yoshida et al. 1974). La miscela di reazione per un saggio di parzialmente purificata polimerasi DNA era la stessa del HSV-1 DNA polimerasi, salvo che il solfato di ammonio è stato omesso e 3 HdTTP stato usato a concentrazioni di 0.428 al 6.84 M. La miscela di reazione (25 l) per il saggio di parzialmente purificata polimerasi DNA contenuto 85 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl 2. 5 mM DTT, 0,5 mg / ml BSA inattivato al calore, 30 mM KCl, 50 g / ml attivato DNA di timo di vitello, 80 M dATP, 80 M dGTP e 80 M dCTP, 0.855 al 6.89 M 3 HdTTP, varie concentrazioni di eugeniin e enzima. velocità di reazione sono stati misurati a varie concentrazioni di 3 HdTTP e valori m K apparenti sono stati valutati graficamente da trame Lineweaver-Burk. valori apparenti K I sono stati determinati graficamente la misura di velocità di reazione in presenza e assenza di concentrazioni fisse di eugeniin (Dixon e Webb, 1979). Tutte le linee lineari in ciascun grafico sono stati disegnati utilizzando un software (CA-grillo Graph III 1.5.2.), E K i e K m valori sono stati calcolati con l'equazione ottenuta dall'analisi computer. Il coefficiente di correlazione di ciascuna linea è stata determinata con un programma per computer (StatView 4.01). Risultati Purificazione di eugeniin da estratti di erbe. Eugeniin è stato isolato dal estratto di erbe di G. japonicum. e la struttura chimica è stata identificata mediante analisi chimico-fisiche. L'estratto di erbe è stato estratto con EtOAc e la frazione EtOAc-estraibile è stato ulteriormente estratto con metanolo per rimuovere materiali metanolo-insolubili, principalmente acido ellagico con citotossicità. La frazione di metanolo solubile è stata separata in 63 frazioni di Sephadex LH-20 cromatografia su colonna. Le frazioni 50 e 51 hanno mostrato la più forte attività anti-HSV-1 tra le 63 frazioni, ed i loro valori di EC 50 erano 16,5 e 17,5 g / ml, rispettivamente (Tabella 1). Queste frazioni sono state separate ulteriormente in sei frazioni (P1 a P6, tabella 1) mediante HPLC. Tra i sei frazioni, frazione P4 esposto più forte-HSV-1 attività anti (EC 50 value, 5,0 0,61 g / ml). I suoi valori CC 50 per cellule Vero e HEL erano 69,3 9,4, 66 e 77 g / ml. Questi CC 50 valori erano 13.9-, 13.2- e 15,4 volte, rispettivamente, superiore al valore EC 50. Struttura chimica per un composto ottenuto dalla frazione P4 è stato identificato come eugeniin (fig 1. 1,2,3-trigalloyl 4,6-hexahydroxydiphenoyl -. d - glucopyranose, peso molecolare, 938 daltons), che è una rappresentazione giallo solido amorfo luce un quasi picco ione molecolare a m / z. 939 MH D 64.5 (c 0,067, acetone) e solubili in acqua. Questo composto è stato isolato come un composto anti-HSV dall'estratto vegetale di S. aromaticum con anti-HSV attività in vitro e in vivo (Kurokawa et al. 1993a. 1995a. 1995b. 1997) (dati non mostrati). Abbiamo coincidenza purificati eugeniin come un importante composto anti-HSV da entrambi estratti di G. japonicum e S. aromaticum, che appartengono a diverse famiglie di piante. Anti-HSV-1 delle frazioni preparati con attività G. japonicum anti-HSV di eugeniin. Attività anti-HSV di eugeniin stato confrontato con wild HSV-1, AP r HSV-1, TK HSV-1 e HSV-2 selvatici ceppi nel test resa-riduzione con Vero cellule (fig.2). Tutti e quattro i ceppi utilizzati erano similmente suscettibile di eugeniin e loro rendimenti virus sono stati ridotti oltre 1.100 volte in presenza di 20 g / ml eugeniin rispetto alla sua assenza. Così questo composto mostrato una potente attività antivirale contro AP r HSV-1, TK HSV-1 e HSV-2 selvatici ceppi nonché selvaggio HSV-1 ceppo. L'inibizione della crescita di vari ceppi HSV da eugeniin. Eugeniin stato confrontato per la sua attività antivirale con wild HSV-1, AP r HSV-1, TK HSV-1 e HSV-2 selvatici ceppi nel test resa-riduzione. cellule Vero sono state infettate con ceppi HSV da 5 a 10 PFU / cellula e incubate in presenza di 0, 10, 20 e 30 g / ml di eugeniin a 37 ° C per 24 h. Le colture sono state congelate, scongelate e poi centrifugate a 3000 rpm per 15 min. titoli virus nel surnatanti sono stati determinati dal saggio di placca. I titoli rappresentano i valori medi con errore standard per i campioni in triplicato. Effetto di eugeniin sulla sintesi del DNA virale. Eugeniin stato esaminato per l'inibizione della sintesi del DNA virale selvaggio HSV-1 e AP-1 r HSV ceppi di cellule Vero da slot blot ibridazione per valutare la modalità della sua azione anti-HSV. Come mostrato in figura 3. eugeniin dose-dipendente sintesi del DNA inibita wild HSV-1 e AP r HSV-1 ceppi, anche se AP r HSV-1 DNA è stato sintetizzato in presenza di PAA. Queste sintesi di DNA virale sono stati fortemente soppressi in presenza di 20 g / ml eugeniin, ei livelli di quantità di DNA identificati erano simili a quelli nelle cellule HSV-1 infettate immediatamente dopo l'adsorbimento del virus e in presenza di 150 g / ml PAA , che ha indicato la completa inibizione della sintesi del DNA virale. sintesi di DNA di TK HSV-1 e HSV-2 selvatici ceppi non erano rilevabili in presenza di 20 g / ml eugeniin sia (dati non mostrati). Eugeniin ha inibito la sintesi del DNA di tutti i ceppi HSV esaminati. L'inibizione della sintesi del DNA di vari ceppi HSV da eugeniin. Effetti della eugeniin e PAA sulla sintesi del DNA virale sono stati esaminati in cellule Vero infettate con wild HSV-1 o AP r HSV-1 ceppi. Le cellule sono state infettate con ceppi HSV-1 (510 PFU / cellula) e poi incubate in presenza di 0 (corsia 2), 5 (corsia 3), 10 (corsia 4) e 20 (corsia 5) g / ml di eugeniin e 150 g / ml di PAA (corsia PAA) a 37 ° C per 8 h. Le cellule sono state lisate e poi il DNA è stato preparato dai lisati. Il DNA è stato cancellato per filtri di nylon a 6.25, 25, 100 e 400 ng / scanalatura e fissato tramite irradiazione UV. In corsia 1, DNA è stato preparato da cellule infette immediatamente dopo l'adsorbimento del virus per 1 h. In corsia 6, DNA è stato preparato da cellule non infettate come controllo negativo. In corsia pTK, plasmide pTK coinvolgendo il frammento di DNA di HSV-1 TK gene è stato cancellato a 10 4. 10 5. 10 6 e 10 7 copie / slot come controllo positivo per HSV-1 DNA. In corsia PAA, DNA preparato da cellule infettate in presenza di 150 g / ml di PAA è stato cancellato a 400 ng / slot. I filtri sono stati ibridizzati con sonde radioattive denaturati come descritto nel testo. I filtri sono stati lavati ibridate ei filtri essiccati sono stati esposti a pellicole per raggi X a 80C. Effetto di eugeniin sulla sintesi proteica virale. Poiché PAA inibisce la sintesi delle proteine ​​HSV DNA e tardiva HSV ma permette la sintesi di proteine ​​di HSV precoce (Honess e Roizman 1973 Honess e Watson, 1977), la sintesi di proteine ​​di HSV è stata esaminata in presenza di eugeniin e PAA confrontare la effetti del PAA e eugeniin sulla sintesi proteica. Come mostrato in Figura 4 e table2. la sintesi delle proteine ​​virali fine è stata notevolmente ridotta in cellule infettate con wild HSV-1 e HSV-2 ceppi in presenza di 150 g / ml PAA rispetto in sua assenza. dose-dipendente Eugeniin ha inibito la sintesi delle proteine ​​virali come 53-, 60-, 67-, 89- e 155-kdalton proteine ​​per Wild HSV-1 e 48-, 57-, 64-, 71-, 80-, 115 - e proteine ​​145-kDalton per Wild HSV-2. L'analisi quantitativa della autoradiogrammi mostrato che le intensità di quelle bande di selvaggio HSV-1 e HSV-2 proteine ​​sintetizzate in presenza di 20 g / ml eugeniin sono stati ridotti in modo simile a quelli in presenza di 150 g / ml PAA (tabella 2) . In AP r cellule HSV-1-infetti, la sintesi di AP r HSV-1 proteine ​​non era marcatamente modificati in presenza o assenza di 150 g / ml PAA, ma dose-dipendente eugeniin ridotto la sintesi delle proteine ​​tardive virali di AP r HSV-1 ceppo. Le concentrazioni (520 g / ml) di eugeniin utilizzati non inibire la sintesi di proteine ​​cellulari ospitanti (fig. 4 e tabella 2). Così eugeniin nonché PAA selettivamente inibisce la sintesi delle proteine ​​tardive HSV senza citotossicità apparente. L'inibizione della sintesi proteica dei vari ceppi di HSV da eugeniin. Eugeniin è stato esaminato per il suo effetto sulla sintesi proteica virale nelle cellule Vero infettate con ceppi di HSV. Le cellule sono state mock-infettati (M) - o infettati con wild HSV-1, AP r HSV-1 o selvatici HSV-2 ceppi e incubata in presenza di 0 (corsia 1), 5 (corsia 3), 10 (corsia 4) e 20 (corsia 5) g / ml di eugeniin o 150 g / ml di PAA (corsia 2) a 37 ° C. Le cellule infette e mock-infettati sono stati etichettati con 35 Smethionine e 35 Scysteine ​​per 5.5 e 7.5 h postinfection in presenza di eugeniin o PAA come descritto nel testo. Gli immunoprecipitati da Wild HSV-1, AP r HSV-1 e HSV-2 cellule infettate selvatici (selvaggio HSV-1, AP r HSV-1 e Wild HSV-2) e lisati totali di cellule di cellule mock-infettate (lisato) erano sottoposti a SDS-poliacrilammide gel elettroforesi seguita da fluorography. proteine ​​marker (30, 46, 69, 97,4 e 200 kdaltons) sono stati co-elettroforesi in ogni gel. teste freccia indicano proteine ​​virali fine cui produzione è stato ridotto in presenza di eugeniin nonché PAA.